Clostridioides difficile w kale, met. Real-Time PCR

Identyfikacja w kale wirulentynych szczepów Clostridium difficile metodą Real Time PCR (RT-PCR). Clostridium difficile (C. difficile) jest Gram dodatnią, beztlenową laseczką przetrwalnikującą, przyczyną rozpowszechnionych zakażeń szpitalnych, szczególnie niebezpiecznych w przypadku szczepów odpornych na antybiotyki. Zakażenie C. difficile, CDI (ang. C. difficile infection) może przebiegać różnie, od biegunki do śmiertelnego rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy. Szczepy antybiotykooporne powstają już w trakcie jednokrotnej terapii, a ich ekspansji w organizmie chorego sprzyja równoczesne zaburzenie mikroflory jelitowej. Zakażenia opornymi na antybiotyki C. difficile  prowadzą do objawów klasyfikowanych łącznie jako: choroba związana z zakażeniem Clostridium difficile, CZCD. Do CZCD zaliczamy: biegunkę poantybiotykową, ADD (ang. antibiotic-associated diarrhoea); poantybiotykowe zapalenie okrężnicy, AAC (ang. antiobiotic-associated colitis) i rzekomobłoniaste zapalenie jelit, PMC (ang. pseudomembranous colitis). W pełni rozwinięta flora bakteryjna u zdrowych dorosłych ludzi jest przeważnie odporna na kolonizację C. difficile. Naruszenie naturalnej mikroflory kolonizację przez C. difficile umożliwia. Najpoważniejszym czynnikiem ryzyka CZDC jest terapia antybiotykami o szerokim spektrum działania, zwłaszcza w warunkach szpitalnych (prewalencja u 20-30% pacjentów szpitalnych vs 3% w ogólnej  populacji). Pierwotnymi czynnikami wirulencyjnymi C. difficile są enterotoksyna A i cytotoksyna B. Geny kodujące toksynę A (tcdA) i toksynę B (tcdB) są częścią patogenicznego locus PaLoc (ang. Pathogenicity Locus). Najbardziej patogenne są szczypy: toksyno-A-pozytywny, toksyno-B-pozytywny (A+B+), chociaż izolaty toksyno-A-negatywne, toksyno-B-pozytywne (A-B+) zostały również określone jako patogenne. Niektóre szczepy C.difficile produkują także aktynospecyficzne ADP-rybosyltransferazy zwane CDT lub toksyną binarną. Locus toksyny binarnej, CdtLoc,  zawiera dwa geny: cdtA i cdtB  i ulokowany jest poza PaLoc. W ciągu kilku ostatnich lat miały miejsce przypadki CDI powodowane przez „hiperwirulentne” i oporne na fluorochinolony szczepy należące do typu 027, PFGE typu NAP1 i REA typu B1. Te szczepy wykazują zwiększoną produkcję toksyn, wiążącą się z delecją w genie regulatorowym tcdC. W teście oznaczane są jakościowo w kale, met. Real Time PCR: toksyna B (sekwencja tcdB); toksyna binarna (cdt) oraz delecja tcdC nt 117 (tcdCΔ117). Przykładowy wynik dodatni testu: Metodą Real-Time PCR wykryto szczep hiperepidemiczny B1/NAP1/027 (tcdCΔ117), toksynę B (cdtB) oraz toksynę binarną (cdt).