Clostridioides difficile w kale, met. Real-Time PCR

Identyfikacja w kale wirulentynych szczepów Clostridioides difficile metodą Real Time PCR (RT-PCR). Clostridioides difficile (C. difficile, C. diff.) jest nazwą nadaną w 2016 r. Clostridium difficile,  gram (+), zarodnikującej, laseczce beztlenowej, o dużym potencjale zakaźnym. C. difficile jest najczęstszą przyczyną biegunki szpitalnej. W sprzyjających warunkach wywołuje zapalenie jelita grubego. Zakażenie szerzy się drogą pokarmową i dotyczy przede wszystkim osób w starszym wieku, przebywających w szpitalach i domach opieki. Patogeneza zakażeń wywołanych przez C. difficile związana jest z wytwarzanymi toksynami, Enterotoksyna A i cytotoksyna B są odpowiedzialne za obraz kliniczny zakażeń C..difficile. Toksyna A jest enterotoksyną atakującą błonę śluzową jelita, a toksyna B jest cytotoksyną od 1000 do 10 000 bardziej toksyczną od  toksyny A. Około 10% szczepów wytwarza dodatkową toksynę binarną. Trzy główne toksyny C. difficile: A, B i toksyna binarna powodują zmiany w jelitach, objawiające się najczęściej w postaci biegunki. W XXI w. w Polsce wykazano utrzymujący się wzrost zachorowań i umieralności  na C. difficile, co wiąże się z  identyfikacją nowego szczepu epidemicznego 027/NAP1/BI, który charakteryzuje się zwiększoną produkcją toksyn A i B, a także produkuje dodatkowo toksynę binarną. W 2020 r. zapadalność w Polsce na C. difficile wynosiła 26,2/100 000. Przebieg choroby może być łagodny lub ciężki i wymagać leczenia w szpitalu. Czynnikiem ryzyka zakażenia jest antybiotykoterapia, zwłaszcza długotrwała i stosowanie kilku różnych antybiotyków. C. difficile uważana jest  za patogen szpitalny. W grupie osób o zmienionej mikrobiocie przewodu pokarmowego, zwłaszcza starszych, śmiertelność z powodu chorób związanych z  C. difficiale, CZCD (ang. CDAD, Clostridium difficile-associated disease) sięga  25%. Na skutek wzrastającej lekooporności  zakażenia C. difficiale dotykają grup dotychczas uważanych za bezpieczne. Charakterystycznymi dla CDAD jednostkami chorobowymi są: biegunka poantybiotykowa  (AAD, ang. antibiotic-associated diarrhoea),15-25% przypadków; poantybiotykowe zapalenie okrężnicy (AAC, ang. antibiotic-associated colitis), 75% przypadków i rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy (PMC,  ang. pseudomembranous colitis), 100% przypadków. Nosicielstwo C. difficile stwierdzane jest w: 3% populacji, ale w  20-40% chorych hospitalizowanych i 50-60% noworodków i niemowląt, u których spada do 3% po 1 roku życia. Chory może zarażać przez okres choroby i bezobjawowego wydalania C. difficile w stolcu (nosicielstwa). Pierwotnymi czynnikami wirulencyjnymi C. difficile są enterotoksyna A i cytotoksyna B. Geny kodujące toksynę A (tcdA) i toksynę B (tcdB) są częścią patogenicznego locus PaLoc (ang. Pathogenicity Locus). Najbardziej patogenne są szczepy: toksyno-A-pozytywny, toksyno-B-pozytywny (A+B+), chociaż izolaty toksyno-A-negatywne, toksyno-B-pozytywne (A-B+) zostały również określone jako patogenne. Niektóre szczepy C.difficile produkują także aktynospecyficzne ADP-rybosyltransferazy zwane CDT lub toksyną binarną. Locus toksyny binarnej, CdtLoc,  zawiera dwa geny: cdtA i cdtB  i ulokowany jest poza PaLoc. W ciągu kilku ostatnich lat miały miejsce przypadki CDI powodowane przez „hiperwirulentne” i oporne na fluorochinolony szczepy należące do typu 027, PFGE typu NAP1 i REA typu B1. Te szczepy wykazują zwiększoną produkcję toksyn, wiążącą się z delecją w genie regulatorowym tcdC. W teście oznaczane są jakościowo w kale, met. Real Time PCR: toksyna B (sekwencja tcdB); toksyna binarna (cdt) oraz delecja tcdC nt 117 (tcdCΔ117). Przykładowy wynik dodatni testu: Metodą Real-Time PCR wykryto szczep hiperepidemiczny B1/NAP1/027 (tcdCΔ117), toksynę B (cdtB) oraz toksynę binarną (cdt).