Nowe badanie molekularne do wykrywania SARS-COV-2: RT- LAMP

Epidemia wirusa SARS-CoV-2 wywarła duży wpływ na funkcjonowanie całego społeczeństwa, w tym również na codzienną pracę większości laboratoriów medycznych. Badania wykorzystywane do rozpoznawania COVID-19, stanowią obecnie dużą część wszystkich wykonywanych oznaczeń, pochłaniając dużą ilość czasu i uwagi diagnostów laboratoryjnych.

Spośród szeregu metod używanych w diagnostyce COVID-19, szczególnie duże znaczenie mają badania molekularne, oparte na wykrywaniu obecności materiału genetycznego wirusa w próbce. Pozwalają one na potwierdzenie zakażenia wirusem SARS-CoV-2 i są rekomendowane przez Światową Organizację Zdrowia. Badania te są jednak czasochłonne, co wpływa na wydłużenie czasu oczekiwania pacjenta na wynik. Z tego względu dąży się do wprowadzania modyfikacji, które pozwolą na skrócenie czasu reakcji, gwarantując jednak wysoką czułość i specyficzność testu.

Kiedy możliwe jest szybsze uzyskanie wyniku badania?

Zastosowanie nowego rodzaju polimerazy (polimerazy Bst)- enzymu używanego w testach opartych o metodę LAMP, umożliwia przeprowadzenie reakcji w stałej temperaturze i efektywne skrócenie czasu jej trwania, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej czułości i specyficzności badania. Modyfikacja ta działa oczywiście z korzyścią dla pacjentów, szczególnie tych podróżujących za granicę lub potrzebujących wyniku badania molekularnego jak najszybciej.

Czym różnią się między sobą testy używane w diagnostyce COVID-19?

Wszystkie testy, używane aktualnie w diagnostyce i epidemiologii COVID-19, opierają się na jednej z trzech podstawowych strategii:

• identyfikacji, czyli wykrywaniu obecności materiału genetycznego wirusa (w przypadku wirusa SARS-CoV-2 jest to RNA), za pomocą technik biologii molekularnej (real time RT-PCR i RT-LAMP)
• identyfikacji białek strukturalnych wirusa, czyli antygenów wirusowych, w wymazie pobranym od pacjenta (testy antygenowe)
• identyfikacji przeciwciał, obecnych we krwi, produkowanych przez organizm człowieka w odpowiedzi na kontakt z antygenami wirusa (testy serologiczne).

Wybór rodzaju zalecanego badania dokonywany jest zawsze na podstawie wykazywanych przez pacjenta objawów, możliwego terminu kontaktu z osobą zakażoną, a także celu, jakiemu ma służyć otrzymany wynik.

Badania molekularne metodą real time RT-PCR w potwierdzeniu zakażenia SARS COV-2

Zgodnie z zaleceniami WHO (Światowej Organizacji Zdrowia), najbardziej czułą i specyficzną metodą potwierdzającą infekcję COVID-19 jest badanie oparte na reakcji odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym: real time RT-PCR (ang. Reverse Transcription and Real-Time Polymerase Chain Reaction).

Do badania, wykonywanego tą metodą, wykorzystywany jest materiał pobrany od pacjenta- najczęściej jest to wymaz z nosogardzieli, ale w rzadkich przypadkach również próbki pochodzące z dolnych dróg oddechowych, takie jak popłuczyny oskrzelikowo-pęcherzykowe, aspirat z jamy nosowo-gardłowej, czy plwocina. Po dotarciu do laboratorium próbka zostaje poddana procesowi izolacji RNA, a następnie powieleniu wyizolowanego materiału genetycznego wirusa, za pomocą metody łańcuchowej reakcji polimerazy, poprzedzonej odwrotną transkrypcją. Identyfikacja wirusa zachodzi dzięki wykorzystaniu tzw. sond genetycznych, które łączą się tylko ze ściśle określonymi powielonymi fragmentami RNA, charakterystycznymi dla wirusa SARS-CoV-2.

Powielenie materiału genetycznego umożliwia wykrycie nawet niewielkich ilości wirusa obecnych w próbce, co sprawia że jest to najbardziej czuły test w diagnostyce COVID-19.

Czym metoda RT-LAMP różni się od pozostałych testów wykrywających wirusa SARS-CoV-2?

Metoda RT-LAMP, podobnie jak badanie real time RT-PCR, wykrywa obecność RNA wirusa, jednak umożliwia szybsze uzyskanie wyniku. Obydwie metody należą do rodziny testów NAAT (z ang. Nucleic Acid Amplification Testing)- badań opartych na amplifikacji, czyli powieleniu specyficznego fragmentu  materiału genetycznego w badanej próbce. W RT-LAMP, zamiast standardowej polimerazy, używana jest opatentowana, termostabilna polimeraza Bst, dzięki której reakcja może zachodzić w stałej temperaturze oraz większa liczba starterów, przyłączających się do określonych fragmentów RNA, co znacząco skraca czas badania, pozwalając jednak na zachowanie bardzo dobrej czułości i specyficzności. Choć czułość badania RT-LAMP jest nieznaczenie niższa od czułości metody real time RT-PCR, to jest ona na tyle wysoka, aby wykryć istotne klinicznie stężenia wirusa w próbce. Dzięki temu wyniki testu RT-LAMP dużo łatwiej jest sklasyfikować na negatywne i pozytywne, unikając wyników nierozstrzygających, wymagających powtórzenia badania.

Uzyskanie pozytywnego wyniku badania RT-LAMP (podobnie jak pozytywny wynik testu real time RT-PCR), szczególnie przy jednoczesnym występowaniu objawów klinicznych, potwierdza rozpoznanie COVID-19.

Należy jednak pamiętać, że ujemny wynik zarówno testu RT-LAMP, jak i real time RT-PCR nie wyklucza w 100% infekcji wirusem SARS-CoV-2.

Czy wynik badania metodą RT-LAMP może być wykorzystany podczas podróży zagranicznych?

W ramach badania RT-LAMP, istnieje możliwość uzyskania zaświadczenia do wyniku testu, opatrzonego certyfikowanym podpisem, które może być następnie wykorzystane przy przekraczaniu granicy lub okazane pracodawcy. W niektórych państwach posiadanie zaświadczenia pozwala również na uniknięcie obowiązkowej kwarantanny.

Osoby planujące podróż do Hiszpanii, Japonii, Niemiec, Szwecji lub Wielkiej Brytanii, już teraz mogą uzyskać zaświadczenie uprawniające do wjazdu do tych krajów na podstawie negatywnego wyniku testu RT-LAMP, w kierunku COVID-19. Lista krajów dopuszczających RT-LAMP, jako metodę weryfikującą zakażenie wirusem SARS-CoV-2, cały czas jednak ulega zmianom, a wszystkie aktualne wytyczne są dostępne na stronie internetowej Ministerstwa Spraw Zagranicznych: https://www.gov.pl/web/dyplomacja/informacje-dla-podrozujacych

Wszystkie osoby, udające się w podróż poza granice Polski, mają obowiązek zapoznać się z aktualnymi wytycznymi i dostosować się do nich. Bardzo ważne jest, aby przed wyjazdem sprawdzić, jakie zaświadczenie jest honorowane przez dane państwo, jaki test molekularny jest niezbędny do jego wystawienia i w jakim języku powinno być ono sporządzone.

Gdzie można wykonać badanie metodą RT-LAMP?

Liczba placówek, w których można wykonać badanie RT-LAMP, w kierunku koronawirusa SARS-CoV-2, stale rośnie. Laboratoria DIAGNOSTYKA, w odpowiedzi na oczekiwania ze strony swoich pacjentów, również oferuje możliwość wykonania testu RT–LAMP, obok real time RT-PCR i pozostałych testów serologicznych z krwi. Wszystkie informacje dotyczące listy placówek oferujących testy molekularne, cen i opisów poszczególnych badań, są dostępne na naszej stronie internetowej (TUTAJ).

Bibliografia:

1. Zhang Y, Odiwuor N, Xiong J, Sun L., Nyaruaba R.O, Wei H, Tanner N.A. Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP, MedRxiv 2020.
2. Dudley DM, Newman CM, Weiler AM, Ramuta MD, Shortreed CG, Heffron AS, et al. (2020) Optimizing direct RT-LAMP to detect transmissible SARS-CoV-2 from primary nasopharyngeal swab samples. PLoS ONE 15(12).
3. Mautner, L., Baillie, CK., Herold, H.M. et al. Rapid point-of-care detection of SARS-CoV-2 using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Virol J 17, 160 (2020).
4. Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, Meurer M, Kremer LP, Kirrmaier D, Freistaedter A, Papagiannidis D, Galmozzi C, Stanifer ML, Boulant S, Klein S, Chlanda P, Khalid D, Barreto Miranda I, Schnitzler P, Kräusslich HG, Knop M, Anders S. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Sci Transl Med. 2020 Aug 12;12(556):eabc7075.