Badanie PCR – co to jest? Jak przebiega badanie met. PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) jest jedną z technik powielania materiału genetycznego, jakim jest DNA. Po przeprowadzeniu reakcji można uzyskać miliony kopii DNA. Jest to metoda, która obecnie powszechnie stosowana jest w genetycznych laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Proces ten opracował w 1983 roku zespół badaczy z USA pod kierunkiem Kary’ego Mullisa. W 1993 r. naukowcy otrzymali nagrodę Nobla. W poniższym artykule opisujemy, jak przebiega proces PCR, jakie wyróżniamy rodzaje tej metody i gdzie znalazła ona zastosowanie.

Badanie PCR – co to jest?

Reakcja PCR jest techniką umożliwiającą wykonanie wielu kopii określonego regionu DNA in vitro, czyli poza organizmem. Aby reakcja PCR przebiegła prawidłowo konieczne jest użycie kliku składników mieszaniny reakcyjnej, które powinny charakteryzować się wysokim stopniem czystości. Zaliczamy do nich: 

• matrycę – czyli wyjściowy fragment DNA, który jest miejscem przyłączenia się starterów. Sekwencja tego fragmentu jest powielana w reakcji łańcuchowej polimerazy. 
• polimeraza DNA – jeden z najważniejszych składników mieszaniny reakcyjnej. Jest to enzym, który umożliwia przyłączenie wolnych nukleotydów do nowo powstającej nici DNA. Nowa nić DNA powstaje na podstawie sekwencji powielanej matrycy. Ilość dodawanej polimerazy DNA jest uzależniona od specyfiki przeprowadzonej reakcji, jednak należy pamiętać aby jej stężenie nie było za wysokie, bo może to prowadzić do powstania niespecyficznych produktów reakcji PCR. Do reakcji PCR używa się termostabilnych polimeraz DNA, które nie ulegają zniszczeniu podczas etapu denaturacji.
• mieszanina deoksynukleotydów (dNTP) – są to dATP, dCTP, dTTP, i dGTP – są one składnikami nowopowstającej nici DNA, od ich stężenia zależy specyficzność reakcji. 
• bufor PCR – odpowiedzialny jest za stworzenie odpowiedniego środowiska reakcji w którym powielana będzie matryca DNA.
• magnez – obecność magnezu w mieszaninie reakcyjnej niezbędna jest do prawidłowego działania polimerazy DNA. Magnez wpływa również na temperaturę przyłączania starterów, denaturacji matrycy i produktów PCR oraz zapewnia specyficzność reakcji.
• startery – to krótkie sekwencje jednoniciowego DNA, przyłączające się do końca 3’ matrycy DNA. W ten sposób tworzą miejsce zapoczątkowania syntezy nowej nici DNA. 

Przykładowe badania genetyczne PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy to jedna z metod, która wykorzystywana jest do wykonania wielu badań genetycznych. Ma ona wiele zalet. Metoda PCR charakteryzuje się wysoką czułością, ponieważ pozwala na wykrycie nawet pojedynczych cząsteczek DNA oraz specyficznością, pozwalającą powielić tylko jeden wybrany fragment DNA. Stosując metodę PCR, nie trzeba koniecznie znać sekwencji badanego genu, a zastosowane startery nie muszą w 100% być specyficzne do matrycy. Reakcja PCR znalazła zastosowanie w medycynie do diagnostyki chorób, do badań prenatalnych, w transplantologii, onkologii i ustaleniu rodzicielstwa. PCR umożliwia zidentyfikowanie materiału genetycznego patogenu, np. koronawirusa, wykorzystywana jest w biotechnologii do namnażania genów, genotypowania i identyfikacji mikroorganizmów. W kryminalistyce umożliwia ustalenie tożsamości ofiar oraz analizę śladów genetycznych pozostawionych na miejscu przestępstwa.

Badanie PCR – jak wygląda?

Badanie PCR jest procesem wieloetapowym. Zanim rozpocznie się całą procedurę badania, konieczne jest odpowiednie pobranie materiału biologicznego, z którego zostanie wyizolowany materiał genetyczny pacjenta. Sposób pozyskania materiału do badań i jego późniejsze przechowywanie w sposób istotny rzutuje na możliwość wykonania PCR i wiarygodność wyników, ponieważ DNA lub RNA mogą podlegać degradacji. Materiał genetyczny pacjenta można wyizolować z wielu rodzajów materiału biologicznego, m.in. krwi, śliny, wycinków pobranych w trakcie biopsji (np. skóry, guzów lub narządów), cebulki włosa itp. Rodzaj materiału biologicznego wykorzystany do badania uzależniony jest od tego co chcemy zbadać u danego pacjenta oraz jaki materiał jesteśmy w stanie uzyskać. 

Typowa reakcja PCR składa się z około 20-40 cykli, ilość cykli należy dobrać odpowiednio do specyfiki danego doświadczenia. Poniżej opisaliśmy poszczególne etapy reakcji PCR.

1. Denaturacja – w trakcie tego etapu mieszanina reakcyjna podgrzewana jest zazwyczaj do temperatury ok. 96 st. C, przez około minutę. W wyniku tego procesu dochodzi do rozerwania wiązań wodorowych, występujących pomiędzy zasadami dwuniciowego DNA i powstaje jednoniciowe DNA, które jest matrycą do dalszych badań.
2. Przyłączanie starterów – jest to kluczowy etap reakcji PCR. Prawidłowy przebieg tego etapu warunkuje odpowiednią wydajność i specyficzność całej reakcji. Przyłączanie starterów odbywa się w temperaturze od 55 st. C do 70 st. C. Temperatura dobierana jest w zależności od sekwencji, długości i stężenia starterów. Etap ten trwa od około 30 s do 60 s. 
3. Elongacja – jest to ostatni etap reakcji PCR. W tym etapie ma miejsce właściwa synteza DNA. Do odpowiedniego przebiegu procesu elongacji niezbędna jest obecność polimerazy DNA w mieszaninie reakcyjnej. Proces elongacji przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze około 72 st. C. Czas trwania tego etapu wynosi około jednej minuty i uzależniony jest od długości i stężenia matrycy oraz temperatury.

Rodzaje badań metodą PCR

Mnogość zastosowań reakcji PCR oraz jej popularność spowodowały modyfikację „standardowego” protokołu badawczego, aby wykorzystać opisaną technikę badawczą do wielu doświadczeń. Obecnie reakcja PCR wykorzystywana jest do celów naukowych oraz jako standaryzowana procedura badania molekularnego w procesach diagnostycznych. Poniżej przedstawiamy najbardziej znane rodzaje reakcji PCR wykorzystywane w laboratoriach.

• Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym – (ang. real-time PCR) podstawą tej metody jest reakcja polimerazy łańcuchowej. Dzięki real-time PCR można stwierdzić obecność lub brak danej sekwencji w próbce badawczej lub oznaczyć ilość kopii DNA, zatem można przeprowadzić analizę jakościową lub ilościową (qPCR). Real-time PCR umożliwia obserwację przyrostu produktu reakcji w czasie jej trwania, jest to możliwe dzięki zastosowaniu fluorochromów, które łączą się z matrycą i mają zdolność emisji promieniowania po wzbudzeniu ich wiązką światła o odpowiedniej długości. 
• PCR z użyciem odwrotnej transkryptazy (ang. reverse transcription PCR, RT-PCR) – podstawą RT-PCR jest synteza cDNA na matrycy RNA w obecności enzymu odwrotnej transkryptazy. To zjawisko wykorzystuje się do klonowania bez konieczności tworzenia biblioteki cDNA lub badania poziomu ekspresji genów. Po etapie syntezy cDNA materiał powielany jest dzięki klasycznej metodzie PCR. Kluczowe dla prawidłowego przebiegu reakcji RT-PCR jest zastosowanie RNA o odpowiedniej jakości, matryca RNA nie może być uszkodzona ponieważ spowoduje to nieprawidłowy przebieg całego procesu. 
• MULTIPLEKS PCR – jest to zmodyfikowana metoda „klasycznego” PCR. Cechą charakterystyczną jest stosowanie więcej niż jednej pary starterów co skraca całkowity czas przebiegu wszystkich analiz, zaoszczędza ilość użytej matrycy i zmniejsza koszty doświadczenia. Podczas jednej reakcji mogą być namnażane różne loci cDNA lub DNA. Do reakcji można użyć jednej lub kilku matryc. Reakcja MULTIPLEKS PCR może być wykorzystywana do testów na ojcostwo lub do badania translokacji w nowotworach. 
• Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR, nPCR) metoda ta umożliwia zwiększenie czułości i specyficzności amplifikacji. W dwóch etapach reakcji PCR wykorzystuje się dwie pary starterów dzięki czemu można wyeliminować niespecyficznie powielane sekwencje. 
• PCR zdegradowanych starterów oligonukleotydowych – metoda ta jest wykorzystywana głównie w przypadku, kiedy dostępna jest niewielka ilość powielanej matrycy, ponieważ możliwe jest powielenie nawet nanaogramowych ilości materiału genetycznego. 

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragment lengh polymorphism, RFLP) – ta technika wykorzystywana jest w celu identyfikacji mutacji znanych wariantów sekwencji DNA. RFLP wykorzystywany jest do stwierdzenia ojcostwa, identyfikacji danej osoby po materiale biologicznym lub oceny ryzyka wystąpienia choroby genetycznej.