Biologia molekularna

Biologia molekularna to dziedzina nauk zajmująca się badaniem struktury i funkcji kwasów nukleinowych (DNA i RNA) oraz białek. W kontekście diagnostyki medycznej, biologia molekularna pozwala na analizę materiału genetycznego badanego pod kątem zmian genetycznych, obecności mutacji nowotworowych, predyspozycji do chorób dziedzicznych oraz identyfikacji patogenów – z niezwykłą precyzją i na bardzo wczesnym etapie. Do rozwoju tej dziedziny przyczyniły się dwa przełomowe odkrycia: wykrycie i opisanie podwójnej helisy DNA przez w 1953 roku przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka oraz wynalezienie metody łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (PCR, ang. Polymerase Chain Reaction) w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa.

Metody biologii molekularnej

Biologia molekularna obecnie stanowi jedno z podstawowych narzędzi wykorzystywanych w diagnostyce klinicznej. Jej zastosowanie jest bardzo powszechne w wielu dziedzinach medycyny. Wiele laboratoriów medycznych rozwinęło pracownie biologii molekularnej oferując coraz szersze panele badań, dzięki czemu diagnostyka na poziomie molekularnym stała się bardziej dostępna dla lekarzy jak i pacjentów. Biologia molekularna opiera się głównie ma metodach takich jak:

• PCR klasyczny – umożliwia amplifikację (powielanie) wybranego fragmentu DNA w warunkach laboratoryjnych. Wymaga użycia specyficznych starterów, które „znajdują” interesujący nas fragment DNA i go namnażają. Jeśli nie ma danego fragmentu w organizmie (np. wirusa czy mutacji) to wynik będzie negatywny. Jeśli fragment zostanie odnaleziony i ulegnie powieleniu, to wynik będzie pozytywny.
• Real-Time PCR (qPCR – PCR w czasie rzeczywistym) – odmiana klasycznego PCR, w którym proces amplifikacji DNA jest monitorowany na bieżąco w czasie. Real-time PCR pozwala na ilościowe oznaczanie liczby kopii DNA/RNA, np. wirusa HIV czy HCV.
• Multiplex PCR – technika PCR, w której amplifikacja kilku różnych fragmentów DNA odbywa się jednocześnie w jednej próbce, przy użyciu wielu par starterów. Ten rodzaj PCR znajduje zastosowanie m.in. w: diagnostyce infekcji wywołanych wieloma patogenami, wykrywaniu kilku mutacji w jednym genie czy w testach ojcostwa (np. profilowanie STR – układy STR to krótkie powtórzenia tandemowe, ang. short tandem repeat). Analiza STR wykorzystywana jest do porównywania powtórzeń alleli w określonych miejscach DNA w dwóch lub więcej próbkach.
• Sekwencjonowanie DNA – pozwala na ustalenie dokładnej sekwencji nukleotydów w cząsteczce DNA, krok po kroku. Obecnie popularna jest metoda NGS (ang. Next Generation Sequencing) – technologia umożliwiająca równoczesne sekwencjonowanie tysięcy genów lub całego genomu. NGS jest stosowane w diagnostyce nowotworów, chorób rzadkich, chorób wieloczynnikowych np. mutacje genuBRCA 1 i 2 w raku piersi.
• Klasyczne metody cytogenetyczne – takie jak kariotypowanie, pozwalają na analizę liczby i struktury chromosomów. Umożliwiają wykrywanie aberracji chromosomowych, takich jak aneuploidie (np. trisomia 21 w zespole Downa) czy translokacje.

Pobranie materiału do badań

Diagnostyka molekularna opiera się na izolacji i analizie kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) pobranych z organizmu człowieka. Materiałem biologicznym mogą być wszystkie tkanki zawierające jądrzaste komórki z DNA, m.in.:

• krew żylna (najczęściej stosowana),
• komórki szpiku kostnego (diagnostyka białaczek),
• wymazy z nosa, gardła, policzka (np. w testach wirusowych),
• ślina, nasienie, mocz, płyn owodniowy,
• wycinki tkanek (np. w diagnostyce onkologicznej),
• płyn mózgowo-rdzeniowy.

​Przed przystąpieniem do badań genetycznych, pacjent powinien odpowiednio się przygotować, zgodnie z zaleceniami laboratorium. W przypadku pobierania:

• wymazu z jamy ustnej, zaleca się, aby pacjent był na czczo lub przynajmniej nie spożywał posiłków, nie pił napojów, nie palił tytoniu ani nie żuł gumy przez co najmniej 2 godziny przed pobraniem próbki. Takie środki ostrożności mają na celu minimalizację ryzyka zanieczyszczenia próbki, co mogłoby wpłynąć na jakość i wiarygodność wyników badania.​
• krwi żylnej, pacjent nie musi być na czczo, chyba że laboratorium wyraźnie zaznaczy inaczej.

Ponieważ badania genetyczne wykorzystują DNA pacjenta, przed ich przeprowadzeniem wymagane jest podpisanie świadomej zgody pacjenta na wykonanie badań z użyciem jego materiału genetycznego. Zgoda pacjenta jest niezbędna do legalnego przetwarzania jego danych genetycznych i zapewnia ochronę jego praw.​

Diagnostyka zakażeń wirusowych

Diagnostyka molekularna w zakażeniach wirusowych pozwala na identyfikację obecności materiału genetycznego (DNA lub RNA) wirusa w organizmie pacjenta, nawet na bardzo wczesnym etapie infekcji, często jeszcze przed pojawieniem się objawów klinicznych. Najczęściej wykorzystywaną metodą jest PCR, a najczęściej badanymi patogenami są wirusy, lecz również bakterie, a niekiedy pasożyty eukariotyczne.

Wśród wirusów można wymienić:

• wirus HIV,
• wirusy zapalenia wątroby HCV i HBV,       
• wirus SARS-CoV-2,
• wirusy grypy (influenza),
• wirus TBEV (ang. Tick-Borne Encephalitis Virus) kleszczowe zapalenie mózgu,
• enterowirusy,
• parwowirusy
• HPV (wirus brodawczaka ludzkiego),
• HSV 1/2 (wirus opryszczki pospolitej),
• EBV (wirus Epsteina-Barr),
• CMV (cytomegalowirus) i wiele innych.

Wśród bakterii:

• Mykoplazmy
• Chlamydie
• Krętki boreliozy (Borrelia spp.)
• Wśród pasożytów toksoplasmę.

Wykorzystanie metod PCR czy RT-PCR w diagnostyce infekcji czułe i dokładne, pozwala wykryć i zidentyfikować materiał genetyczny patogenu  z prawie 100% dokładnością.

Diagnostyka molekularna nowotworów

Współczesna diagnostyka molekularna nowotworów opiera się głównie na identyfikacji mutacji genowych, rearanżacji chromosomalnych, amplifikacji genów, a także poziomu ekspresji genów. Geny, których zmiany najczęściej predysponują do rozwoju nowotworów zostały przedstawione w Tabeli 1.

Tabela 1. Lista najczęstszych genów, których zmiany sekwencji DNA predysponują do rozwoju nowotworów.

Diagnostyka chorób genetycznych

Choroby genetyczne wynikają z mutacji w DNA, które mogą być dziedziczone lub powstawać de novo, czyli spontanicznie, już na etapie zapłodnienia lub w pierwszych podziałach komórkowych zarodka. Mogą być uwarunkowane mutacjami  w pojedynczym genie – choroby monogenowe, jak również aberracjami liczbowymi lub strukturalnymi całych chromosomów – choroby chromosomalne. Przykładami chorób monogenowych są:

• mukowiscydoza (gen CFTR),
• fenyloketonuria (gen PAH, hydroksylazy fenyloalaninowej),
• dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD, ang. Duchenne muscular dystrophy),
• niedokrwistość sierpowata (gen beta hemoglobiny, HBB ang. hemoglobin beta gene), 
• rdzeniowy zanik mięśni (gen białka SMN1 (ang. survival motor neuron),
• achondroplazja/karłowatość (gen białka receptora czynnika wzrostowego 3 fibroblastów 3, FGFR3 ang. fibroblast growth factor receptor 3).

W przypadku chorób chromosomalnych, takich jak zespół Downa (trisomia 21), zespół Turnera (monosomia X) czy zespół Klinefeltera (XXY), stosuje się techniki cytogenetyczne (oznaczenie kariotypu) i molekularne (PCR i sekwencjonowanie). Wspomniane metody pozwalają wykryć zarówno duże zmiany liczby chromosomów, jak i drobne delecje lub duplikacje niewidoczne w klasycznym badaniu kariotypu.

Diagnostyka preimplantacyjna i prenatalna

Diagnostyka prenatalna to dziedzina medycyny, która umożliwia ocenę zdrowia i rozwoju płodu jeszcze w okresie ciąży lub na etapie zarodka.

Biologia molekularna ma szerokie zastosowanie w testach preimplantacyjnych i prenatalnych:

I. Nieinwazyjne testy prenatalne, NIPT (ang. noninvasive prenatal testing) – wykorzystują analizę wolnego DNA płodowego obecnego w krwi matki. Izolowane jest wolnokrążące DNA płodowe (cffDNA, ang. cell‐free fetal DNA) obecne w krwi matki. Diagnostyka możliwa jest już od 10 tygodnia ciąży. Testy NIPT umożliwiają wykrycie najczęstszych trisomii chromosomu: 21 (zespół Downa), 18 (zespół Edwardsa), 13 (zespół Pataua), aneuploidii chromosomów płci i mikrodelecji.

Technologia ta opiera się głównie na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS) oraz analizie ilościowej fragmentów DNA. Genetyczne badania NIPT charakteryzują się bardzo wysoką czułością i swoistością.

II. Diagnostyka preimplantacyjna, PGT (ang. preimplantation genetic testing) – wykorzystywana jest w procedurze zapłodnienia in vitro.  Polega na pobraniu od 5 do 10 komórek trofoektodermy (komórki przyszłego łożyska) z 5-6 dniowego zarodka i analizie ich DNA. Pozwala na wybór do implantacji zarodków wolnych od aneuploidii czy ciężkich chorób genetycznych występujących w rodzinie. Metodą biologii molekularnej stosowanej w diagnostyce PGT jest sekwencjonowanie nowej generacji, NGS.

III. Badania DNA płodowego z płynu owodniowego lub trofoblastu – to inwazyjne metody pobierania materiału genetycznego. Do metod inwazyjnych zalicza się: biopsję kosmówki, amniopunkcję – najczęściej wykonywaną po 15. tygodniu ciąży, czy kordocentezę – pobranie krwi pępowinowej.

Materiałem biologicznym są komórki płodu (z kosmówki lub płynu owodniowego), z których izoluje się DNA. Następnie wykonuje się kariotyp metodami cytogenetycznymi, PCR w kierunku konkretnych mutacji (np. mukowiscydoza, SMA), czy NGS – w diagnostyce chorób monogenowych i zespołów wielogenowych.

Badania ojcostwa i pokrewieństwa

Podstawą badań genetycznych wykonywanych w kierunku badania ojcostwa i pokrewieństwa jest analiza unikalnych sekwencji DNA, które każde dziecko dziedziczy w połowie od matki, a w połowie od ojca biologicznego. Dzięki temu możliwe jest jednoznaczne potwierdzenie lub wykluczenie biologicznego ojcostwa, a także innych relacji rodzinnych, takich jak macierzyństwo, rodzeństwo czy pokrewieństwo dalszego stopnia.

Badania te wykonuje się na podstawie analizy wspomnianych markerów genetycznych STR – krótkich powtarzających się sekwencji DNA, zlokalizowanych w niekodujących fragmentach genomu oraz z wykorzystaniem metody multiplex PCR (zestaw 24 markerów). Każdy człowiek ma unikalny zestaw tych markerów, a ich kombinacja tworzy indywidualny „profil genetyczny”. Biologia molekularna stała się nieodłącznym elementem współczesnej diagnostyki, oferując szybkie, czułe i precyzyjne metody wykrywania chorób na poziomie genetycznym. Obecnie nie jest już narzędziem przyszłości, lecz standardem codziennej praktyki klinicznej.